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 為什么提取出的總RNA會(huì)降解?為什么OD260/280不在1.8-2.0之間？

為什么。。。小伙伴們?nèi)绻羞@些疑問(wèn)的話，不防往下看看到底是為什么。

1、使用前防范：TRIzol劇毒且易揮發(fā)（由于主要成分是苯酚），lv仿呢也是一種有毒也易揮發(fā)的試劑，有的小盆友為了防止氧化，還會(huì)加入β巰基乙醇，這個(gè)反正建議有鼻子的童鞋都做好防護(hù)。提取RNA前做好保護(hù)措施，在通風(fēng)廚中操作，所有接觸TRIzol的耗材，扔到專(zhuān)門(mén)的密封的桶中，等待處理。否則整個(gè)實(shí)驗(yàn)室都會(huì)彌漫著氣味！

2、*前奏：所有耗材（槍頭、EP管）均經(jīng)過(guò)RNA酶滅活或者直接購(gòu)買(mǎi)無(wú)RNA酶的耗材，除RNA酶主要方法是用DEPC水浸泡48小時(shí)（DEPC雖然味道香，但卻是強(qiáng)致癌的，泡管子的時(shí)候別一直去聞它，一般來(lái)說(shuō)煮沸或高溫高壓滅菌15min后，DEPC就會(huì)降解成二氧化碳和水），操作前戴口罩。

3、RNA非常容易降解，所有步驟盡量在冰盒里面操作，包括離心時(shí)需用4度預(yù)冷的離心機(jī)。

4、1-5×10^7細(xì)胞或者50-100mg組織加入1ml TRIzol，細(xì)胞或者組織過(guò)多，TRIzol過(guò)少會(huì)導(dǎo)致裂解不充分，內(nèi)源性RNA酶抑制不*，導(dǎo)致RNA降解。

5、TRIzol加入細(xì)胞后，反復(fù)吹打，充分裂解細(xì)胞至均一透亮，不粘稠為止。

6、加入Lv仿后充分混勻，其實(shí)這步也不能過(guò)于劇烈，上層的水相含有RNA，中間的組織相含有DNA和蛋白質(zhì)，剩余的一部分DNA會(huì)萃取到lv仿中，同時(shí)lv仿具有使蛋白質(zhì)變性的作用，離心完，中間那層就是組織層。

7、離心后，溶液分層，上層為含有RNA的水相，中間層乳白色的為含有部分DNA、蛋白質(zhì)的組織層，下層紅色的為含有DNA和部分蛋白質(zhì)的lv仿, 此時(shí)，注意，“寧少勿多”，提取上層無(wú)色液體時(shí)，小心輕柔，可以用200ul的槍抽吸，特別注意：一般1ml的TRIzol時(shí)zui多可以提取500μl上清，但是建議提取400ul以下，千萬(wàn)避免吸到中間的乳白色組織層，否則zui后測(cè)量RNA時(shí)，OD260/280非常低，會(huì)有蛋白混入。

8、異丙醇加入的目的是為了使RNA沉淀，此時(shí)RNA已經(jīng)提出來(lái)了，應(yīng)輕輕混勻，避免RNA損傷。離心后肉眼可見(jiàn)EP管底部白色羽毛狀沉淀即為RNA沉淀。


9、75%乙醇加入的目的是為了洗滌和沉淀作用，也應(yīng)該輕柔。

10、zui后乙醇應(yīng)盡量充分揮干，先用槍頭盡量把75%乙醇吸干，再晾5min，否則沒(méi)有晾干乙醇，加入DEPC水時(shí)可能導(dǎo)致RNA白色沉淀不溶解。

11、加入DEPC水溶解RNA時(shí)，可根據(jù)自己需要的濃度來(lái)調(diào)整加入DEPC水的量。

12、RNA提取后可以跑瓊脂糖膠來(lái)判斷降解情況，純的無(wú)降解的RNA跑完瓊脂糖膠后應(yīng)該有3條帶，26S，18S， 5S。其中5S很淡，不容易看見(jiàn)。如果條帶很淡，且有拖尾現(xiàn)象，提示有RNA降解。